INTRODUCCIÓN
Los desechos o subproductos agrícolas a nivel mundial son generados en grandes volúmenes, siendo sólo una mínima parte de ellos reutilizada (Ojeda y Cáceres, 2002), por lo que representan un problema ambiental (Londoño-Londoño et al., 2012).
A partir de los años 60, el mercado de los jugos y conservas de frutas empezó a desarrollarse en el Ecuador. Gracias al clima favorable del país, es posible el cultivo de varias frutas para la elaboración de bebidas y néctares; entre las que se encuentran maracuyá y naranja (Plaza, 2018).
El procesamiento del maracuyá genera alrededor del 75% de subproductos, respecto al peso de la fruta, mientras que el de la naranja produce entre 45 y 60% de subproductos. Los subproductos del maracuyá son utilizados como material coadyuvante a la fermentación de yogurt (Do Espírito Santo et al., 2012) o potenciador de aromas (Leão et al., 2014), mientras que los de naranja son utilizados para la alimentación de rumiantes, obtención de aceites esenciales (Gonzales, 2007) y pectina (Rentería, 2014).
Los compuestos fenólicos, que se presentan de forma natural en las frutas y vegetales, poseen actividad antioxidante (Pérez-Nájera et al., 2013), actividad bacteriostática, fungicida y viricida, siendo más efectivos sobre las bacterias gram-positivas que sobre las gram-negativas (Abud-Blanco et al., 2015).
El consumo frecuente de frutas y vegetales está asociado a la mayor ingesta de compuestos fenólicos de carácter antioxidante, que conducen al menor desarrollo de enfermedades crónicas como las enfermedades cardiovasculares (Tenea y Lara, 2019).
La actividad antimicrobiana de los compuestos fenólicos es de gran interés para aplicaciones en la industria de alimentos, debido a la mayor aceptación que tiene el consumidor hacia los productos naturales y al uso más restringido de los compuestos sintéticos, dada la toxicidad de estos últimos (Amensour et al., 2010). Las técnicas de extracción de compuestos fenólicos empleadas son las convencionales con solventes (Alara et al., 2018) y no convencionales como las asistidas con microondas (Alara and Abdurahman, 2019), asistidas con ultrasonido (Shirzad et al., 2017) y con fluidos supercríticos (De Zordi et al., 2014).
Con base en lo expuesto, el presente trabajo tuvo como objetivo investigar si los extractos alcohólicos del epicarpio-albedo de maracuyá (Passiflora edulis) y del exocarpo-mesocarpio de la naranja (Citrus sinensis), poseen propiedades inhibitorias in vitro frente a dos bacterias gram-positivas Listeria monocytogenes y Streptococcus mutans, dos bacterias gram-negativas Salmonella spp, Escherichia coli y dos hongos Penicillium sp. y Rhizopus spp.
MATERIALES Y MÉTODOS
Las muestras de exocarpo-mesocarpio de naranja (EM naranja) se las obtuvo de un local de expendio de jugos de fruta, mientras que las de epicarpio-albedo de maracuyá (EA maracuyá) de frutas adquiridas en un mercado local, ambos de la ciudad de Manta, Ecuador.
Las muestras de EA maracuyá y de EM naranja se secaron en una estufa a una temperatura de 50°C. Una vez secos, los materiales se trituraron con ayuda de un molino casero (molino Corona, Colombia) y posteriormente se tamizaron, desechándose las partículas con tamaño superior a 1 mm.
Se utilizaron cepas de Escherichia coli (ATCC CECT-4076), Salmonella spp. (ATCC CECT-708), Listeria monocytogenes (ATCC CECT-5672) que fueron aisladas de queso perteneciente a una Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). La cepa de Streptococcus mutans ATCC 35668, mientras que las cepas de Penicillium y Rhizopus fueron aisladas de mandarina y papaya respectivamente.
Extracción alcohólica
La extracción alcohólica se realizó de acuerdo con el método propuesto por Slinkard y Singleton (1977), 15 g del material molido se mezclaron con 150 mL de etanol (95% v/v) con agitación constante durante 24 h a 20°C. La mezcla obtenida se filtró y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio hasta que se obtuvo un residuo seco (Espinosa y Santacruz, 2017).
Curva de crecimiento
Para la realización de la curva de crecimiento se empleó el método propuesto por Puupponen et al. (2001). Se inoculó 10 mL de agua de peptona con 1 o 5% del cultivo (dependiendo del microorganismo) y posteriormente el extracto alcohólico, previamente extraído, se agregó en concentraciones de 0,05 y 0,1%. La solución preparada se inoculó en medios de cultivo específicos, agar Salmonella-Shigella (Tm media, India) para las bacterias Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Escherichia coli, mientras que para Streptococcus mutans se usó el medio de cultivo agar sangre de cordero (Bioxon, México). Las muestras se diluyeron con agua de peptona para luego ser sembradas por triplicado en cajas Petri de 6 cm de diámetro, e incubadas a 37°C por 24 h. Se tomaron muestras del crecimiento bacteriano para los tiempos de 2, 4, 6, 8 y 24 h de incubación, para realizar un recuento de microorganismos haciendo uso de un contador de colonias (Suntex, Taiwan).
Inhibición in vitro de microorganismos
La actividad antimicrobiana de los extractos se determinó según CLSI (2009). Se inoculó el microorganismo a analizar en medio de cultivo agar y se incubó a 37°C durante 24 h. Se sumergieron discos de papel de filtro (Fisher Scientific Q2) de diámetro de 5 mm en una solución de los extractos con concentraciones de 0,05 y 0,1 %. Los discos se colocaron en el centro de una placa de Petri en donde se había sembrado previamente el microorganismo, para luego incubarla a 37°C durante 2 días. El diámetro de la zona de inhibición se midió después de 24 h por triplicado y se clasificó de la siguiente manera: no inhibición (6 mm), ligera inhibición (6 a 8 mm), inhibición moderada (8 a 10 mm), +++: inhibición fuerte (>10 mm).
Diseño experimental
Se utilizó un arreglo factorial 2x2 en un diseño completamente al azar correspondiente al uso de dos factores: residuo de la fruta, con dos niveles (epicarpio-albedo del maracuyá y exocarpo-mesocarpio de la naranja) y concentración del extracto alcohólico, con dos niveles (0,05 y 0,1 %).
Análisis estadístico
Se utilizó el paquete estadístico Infostat (Infostat versión 2014, Argentina) para el análisis de varianza y la prueba de medias con el test de Tukey (p≤0,05 %). Todas las medidas se realizaron por triplicado.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Inhibición in vitro de bacterias gram-positivas (Listeria monocytogenes, Streptococcus mutans) frente a extractos alcohólicos
Los resultados (Cuadro 1) mostraron una relación directa entre la concentración del extracto alcohólico y el diámetro de la zona de inhibición, sin que existan diferencias (p≤0,05). La concentración al 0,1% del extracto de EM naranja tuvo el mayor efecto inhibitorio sobre Listeria monocytogenes y S. mutans, y fue diferente al producido por el extracto de EA maracuyá al 0,05% (Cuadro 1). La inhibición de EM naranja al 0,1% sobre L. monocytogenes fue fuerte, mientras que para EA maracuyá al 0,05% sobre S. mutans fue ligera. Las diferencias en inhibición podrían ser el resultado de diferentes compuestos fenólicos presentes en las frutas analizadas. En ambos casos, el poder inhibitorio de los compuestos fenólicos sobre las bacterias gram-positivas puede deberse a su capacidad de afectar la pared celular de las bacterias (Puupponen et al., 2001). Corzo (2012) mostró la acción inhibitoria de los compuestos fenólicos de frutas sobre bacterias gram-positivas, con zonas de inhibición de 10 mm de diámetro a una concentración de 100 µg/µl. Resultados de inhibición similares, 10,67 mm, fueron obtenidos en la presente investigación a concentraciones menores de extracto (0,1%). Kim y Shin (2012) mostraron que los extractos de semilla de Citrus trifoliate tuvieron actividad inhibitoria contra Listeria pero no contra S. mutans. En este último caso, la falta de acción inhibitoria contra S. mutans podría deberse a la variedad de naranja utilizada.
Cuadro 1. Resultados del diámetro de la zona de inhibición de soluciones de extractos de EA maracuyá y EM naranja sobre Listeria monocytogenes y Streptococcus mutans
|
Tratamiento (concentración del extracto alcohólico, %) |
Listeria monocytogenes |
Streptococcus mutans |
|
Diámetro de la zona de inhibición (mm) |
||
|
M (0,05)1 |
8,22++A |
7,67+A |
|
M (0,1) 1 |
9,22++A,B |
9,00++A,B |
|
N (0,05) 2 |
9,11++A,B |
8,44++A,B |
|
N (0,1) 2 |
10,67+++B |
9,33++B |
Valores promedios seguidos de letras superíndices diferentes indican diferencia estadística por la prueba de Tukey (p≤0,05 %).
-: no inhibición (6 mm), +: ligera inhibición (6 a 8 mm), ++: inhibición moderada (8 a 10 mm), +++: inhibición fuerte (>10 mm).
1M: extracto alcohólico del EA maracuyá
2N: extracto alcohólico del EM naranja
Inhibición in vitro de extractos alcohólicos frente a bacterias gram-negativas (Salmonella spp, Escherichia coli)
Los resultados (Cuadro 2) mostraron una relación directa entre la concentración del extracto alcohólico y el diámetro de la zona de inhibición solo para EM naranja, siendo mayor la inhibición para la más alta concentración (p≤0,05). La concentración al 0,1% de extracto alcohólico de EM naranja y EA maracuyá tuvieron el mayor efecto inhibitorio sobre Salmonella spp. (Cuadro 2), mientras que los extractos de EA maracuyá al 0,05% tuvieron la menor inhibición (p≤0,05). La concentración del extracto alcohólico de EA maracuyá al 0,1% tuvo el mayor efecto inhibitorio sobre la bacteria Escherichia coli, mientras que el menor efecto inhibitorio fue el obtenido por el extracto de EM naranja al 0,1%, p≤0,05 (Cuadro 2). La inhibición de EM naranja al 0,1% sobre Salmonella spp fue fuerte, mientras que contra E. coli fue ligera. Así mismo los extractos de EA maracuyá al 0,05% tuvieron una ligera acción antimicrobiana sobre E. coli.
Según Tahera et al. (2014) los extractos alcohólicos (mentanol y etanol) tuvieron efecto inhibitorio contra Salmonella spp, mientras que los extractos acuosos no tuvieron ningún efecto contra el microorganismo. Esto sugiere la existencia de actividad antimicrobiana de los compuestos extraídos con alcoholes. Extractos etanólicos de tallos de maracuyá mostraron actividad antimicrobiana contra E. coli, con una zona de inhibición de diámetro entre 7 y 9 mm, pero no contra Salmonella spp (Aernan et al., 2013). Al parecer la eficiencia del extracto depende no solo del solvente utilizado, sino de la concentración utilizada (Mohanasundari et al., 2007).
Cuadro 2. Resultados de la zona de inhibición de extracto alcohólico de EA maracuyá y EM naranja sobre Salmonella spp. y Escherichia coli
|
Tratamiento |
Salmonella spp |
Escherichia coli |
|
Diámetro de la zona de inhibición (mm) |
||
|
M (0,05)1 |
7,89+A |
8,33++A,B |
|
M (0,1) 1 |
9,22++A,B |
9,78++B |
|
N (0,05) 2 |
8,44++A |
8,78++A,B |
|
N (0,1) 2 |
10,22+++B |
7,67+A |
Valores promedios seguidos de letras superíndices diferentes indican diferencia estadística por la prueba de Tukey (p≤0,05 %).
-: no inhibición (6 mm), +: ligera inhibición (6 a 8 mm), ++: inhibición moderada (8 a 10 mm), +++: inhibición fuerte (>10 mm).
1M: extracto alcohólico del EA maracuyá
2N: extracto alcohólico del EM naranja
Inhibición in vitro de extracto alcohólico de EM naranja y EA maracuyá frente a hongos (Penicillium sp y Rhizopus spp)
Los resultados mostraron una relación directa entre concentración del extracto alcohólico y el diámetro de la zona de inhibición (p≤0,05), con excepción del EM naranja sobre Penicillium sp. La concentración al 0,05% de extracto alcohólico de EA maracuyá tuvo el menor efecto inhibitorio sobre Penicillium, en relación a los otros tres tratamientos, los cuales fueron similares entre sí (p≤0,05) (Cuadro 3). Los extractos alcohólicos de EM naranja y EA maracuyá a 0,05% tuvieron iguales efectos de inhibición sobre Rhizopus, que los extractos de EM naranja a la misma concentración, siendo menores al efecto inhibitorio de EM naranja y EA maracuyá al 0,01%, p≤0,05 (Cuadro 3). La acción inhibitoria de extractos de EA maracuyá al 0,05% fue ligera sobre ambos hongos, así como los de EM naranja al 0,05% sobre Rhizopus spp. No hubo acción inhibitoria fuerte de ninguno de los extractos sobre los hongos estudiados.
Christ-Ribeiro et al. (2019) emplearon extractos del pericarpio de arroz y spirulina e inhibieron el crecimiento de Penicillium verrucosum y Rhizopus oryzae en el 39,8 y 20,2%, respectivamente. A pesar de no poder comparar directamente los resultados con los del presente estudio, es evidente la presencia de compuestos fenólicos con efecto antifúngico en ambos casos.
Cuadro 3. Resultados del diámetro de la zona de inhibición de extracto alcohólico de EA maracuyá y EM naranja sobre Penicillium y Rhizopus
|
Tratamiento |
Penicillium sp. |
Rhizopus spp. |
|
Diámetro de la zona de inhibición (mm) |
||
|
M (0,05)1 |
7,67+A |
7,44+A |
|
M (0,1)1 |
9,22++B |
9,11++B |
|
N (0,05)2 |
9,11++B |
7,67+A |
|
N (0,1)2 |
9,56++B |
9,0++B |
Valores promedios seguidos de letras superíndices diferentes indican diferencia estadística por la prueba de Tukey (p≤0,05 %)
-: no inhibición (6 mm), +: ligera inhibición (6 a 8 mm), ++: inhibición moderada (8 a 10 mm), +++: inhibición fuerte (>10 mm).
1M: extracto alcohólico del EA maracuyá
2N: extracto alcohólico del EM naranja
Curvas de crecimiento de Listeria monocytogenes, Streptococcus mutans, Salmonella spp, Escherichia coli, Penicillium sp, y Rhizopus spp frente a extractos alcohólicos de EM naranja y EA maracuyá
En la figura 1 se puede observar que las UFC (normalizadas) de Listeria monocytogenes y Streptococcus mutans en presencia de extractos alcohólicos de EA maracuyá y EM naranja a la concentración de 0,1% disminuyó en un período de 6 h, luego de lo cual se redujo la velocidad de disminución. Los extractos de EA maracuyá produjeron una mayor reducción de las UFC frente a estas dos bacterias gram-positivas en relación a los de EM naranja en el transcurso de las 24 h de estudio. Según Pupponen et al. (2001) las variaciones de poder inhibitorio encontradas pueden deberse a las diferencias estructurales de las superficies celular de las bacterias.
Figura 1. Curva de crecimiento de (a) Listeria monocytogenes y (b) Streptococcus mutans frente a extractos alcohólicos de EM naranja (rombos sombreados) y EA maracuyá (cuadrados sombreados) al 0,1%
En la figura 2a, se observa que la inhibición de Salmonella spp. a partir de las 6 h de análisis fue completa bajo la acción de extractos de EA maracuyá a la concentración de 0,1%, siendo esta inhibición mayor que la de EM naranja. En el Figura 2b, se puede observar que la bacteria Escherichia coli se inhibió completamente a las 6 h de estudio en presencia de extractos de las dos frutas.
Figura 2. Curva de crecimiento de (a) Salmonella spp y (b) Escherichia coli frente a extractos alcohólicos de EM naranja (rombos sombreados) y EA maracuyá (cuadrados sombreados) al 0,1%
La inhibición total de Rhizopus spp y Penicillium sp se da a partir de las 4 y 6 horas respectivamente (Figura 3) mediante el empleo de extractos alcohólicos tanto de EM naranja como de EA maracuyá a una concentración del 0,1%.
Carrillo-Inungaray et al. (2006) mostraron que la inhibición de Penicillium digitatum y Rhizopus oryzae en presencia de soluciones con solutos de carácter orgánico e inorgánico se debe a la disminución de la actividad de agua. Posiblemente, la presencia de compuestos fenólicos podría producir cambios de actividad de agua que también contribuyan a la inhibición de los microorganismos.
Figura 3. Curva de crecimiento de (a) Penicillium sp y (b) Rhizopus spp frente a extractos alcohólicos de EM naranja (rombos sombreados) y EA maracuyá (cuadrados sombreados) al 0,1%
CONCLUSIONES
Soluciones de extractos alcohólicos en concentraciones del 0,1%, de exocarpo-mesocarpio de naranja y epicarpio-albedo de maracuyá, tuvieron el mayor poder inhibitorio frente a Listeria monocytogenes, Streptococcus mutans, Salmonella spp, Escherichia coli, Penicillium sp, y Rhizopus spp. El método de difusión de discos mostró que las bacterias fueron más inhibidas por los extractos del exocarpo-mesocarpio de la naranja y los del epicarpio-albedo del maracuyá en relación a los hongos, con inhibiciones completas entre las 6 y 24 h. Por otro lado, se observó que la inhibición completa de los hongos se dio entre las 4 y 6 h, por acción de ambos extractos.
LITERATURA CITADA
Abud-Blanco, K., Bustos-Blanco, L., Covo-Morales, E., Fang-Mercado, L. 2015. Actividad antimicrobiana de los compuestos fenólicos sulfonados en el sistema de conductos radiculares. Revisión sistemática. Revista CSV. 7(2): 53-60.
Aernan, P., Aondofa, T., Angbian, T. 2013. In-Vitro Antibacterial Activity of Leaf and Stem Extract of Passiflora edulis (Passion Fruit) Planted in Federal University of Agriculture Makurdi, Central Nigeria. International Journal of Science and Research. 5: 499-503
Alara, O., Abdurahman, N., Ukaegbu, C. 2018. Soxhlet extraction of phenolic compounds from Vernonia cinerea leaves and its antioxidant activity. J. Appl. Res. Med. Aromat. Plants. 11: 1-6
Alara, O., Abdurahman, N. 2019. Microwave-assisted extraction of phenolics from Hibiscus sabdariffa calyces: kinetic modelling and process intensification Ind. Crop. Prod. 137: 528-535
Amensour, M., Sendra, E., Abrini, J., Perez- Álvarez, J., Fernandez-Lopez, J. 2010. Actividadad antioxidante y compuestos fenólicos de extracto de mirto. CyTA-Journal of Food. 8(2): 95-101.
Carrillo-Inungaray, M., Ramírez-Zapata, M., Martínez-Castilleja, J. 2006. Efecto de solutos sobre el crecimiento de hongos deteriorativos de alimentos. Efecto de solutos sobre los parámetros de crecimiento de moldes de alimentos de alimentos. CyTA- Journal of Food. 5(2):142-146.
Clinical and Laboratory Standards Institute. 2009. Method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; Approved Guideline-Second Edition. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI document M44–A2
Corzo, D. 2012. Evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto etanólica. Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas. 43(3): 66-70
Christ-Ribeiro, A., Graça, C., Kupski, L., Badiale-Furlong, E., de Souza-Soares, L. 2019. Cytotoxicity, antifungal and antimycotoxins effects of phenolic compounds from fermented rice bran and Spirulina sp. Process Biochemistry. 80: 190-196
De Zordi, N., Cortesi, A., Kikic, I., Moneghini, M., Solinas, D., Innocenti, G., Portolan, A., Baratto, G., Dall’Acqua, S. 2014. The supercritical carbon dioxide extraction of polyphenols from propolis: a central composite design approach. J. Supercrit. Fluids. 95: 491-498. DOI:https://10.1016/j.supflu.2014.10.006
Do Espírito Santo, A., Perego, P., Convertí, A., Oliveira, M. 2012. Influence of milk type and addition of passion fruit peel powder on fermentation kinetics, texture profile and bacterial viability in probiotic yoghurts. LWT - Food Science and Technology. 47(2): 393-399.
Espinosa, A., Santacruz, S. 2017. Phenolic compounds from the peel of Musa Cavendish, Musa acuminata and Musa cavandanaish, Ecuador. Revista Politécnica 38(2): 69-74
Gonzales, N. 2007. Elaboración de galletas con harina de bagazo de naranja. Tesis Licenciatura. UAEH. Hidalgo, Mexico. p 82
Kim, S., Shin, K. 2012. Antimicrobial Activity of Trifoliate Orange (Poncirus trifoliate) Seed Extracts on Gram-Positive Foodborne Pathogens. Korean J. Food & Nutr. 25: 284-290
Leão, M., Sampaio, L., Pagani, C., Da Silva, M. 2014. Odor potency, aroma profile and volatiles composition of cold pressed oil from industrial passion fruit residues. Industrial Crops and Products. 58: 280
Londoño-Londoño, J., Sierra, J., Álvarez, R., Restrepo, A., Pássaro, C. 2012. Aprovechamiento de los subproductos citrícolas. Medellín, Colombia, Corporación Universitaria Lasallista. P 367.
Mohanasundari, C., Natarajan, D., Srinivasan, K., Umamaheswari, Ramachandran, A. 2007. Antibacterial properties of Passiflora foetida L. – a common exotic medicinal plant. African Journal of Biotechnology. 6: 2650 – 2653.
Ojeda, F., Cáceres, O. 2002. Principales avances en la utilización de los subproductos agroindustriales. Pastos y Forrajes. 25(1): 21
Pérez-Nájera, V., Lugo-Cervantes, E., Gutiérrez-Lomelí, M., Del-Toro-Sánchez, C. 2013. Extracción de compuestos fenólicos de la cáscara de lima (Citrus limetta risso) y determinación de su actividad antioxidante. Biotecnia. 15(3): 18-22.
Plaza, M. 2018. Análisis del comportamiento de consumo de pulpa congelada de frutas exóticas ecuatorianas en la ciudad de Guayaquil. Tesis. Universidad Católica de Santiago de Guayaquil. Guayaquil. EC.
Puupponen, R., Nohynek, L., Meier, C., Kahkonen, M., Heinonen, M., Hopia, A., Oksman, K. 2001. Antimicrobial properties of phenolic compounds from berries. Journal of Applied Microbiology. 90: 494-507
Rentería, J. 2014. Procesamiento de frutas de maracuyá (Pasiflora edulis) para obtención de pectina. Tesis Ingeniería. UTMACH. Machala. EC. p 55.
Shirzad, H., Niknam, V., Taheri, M., Ebrahimzadeh, H. 2017. Ultrasound-assisted extraction process of phenolic antioxidants from Olive leaves: a nutraceutical study using RSM and LC–ESI–DAD–MS. J. Food Sci. Technol. 54: 2361-2371. DOI: https://10.1007/s13197-017-2676-7
Slinkard, K., Singleton, V.L. 1977. Total phenol analyses: automation and comparison with manual methods. American Journal of Enology and Viticulture. 28: 49-55
Tahera, J., Feroz, F., Das Senjuti, J., Kanta Das, K., Noor. R. 2014. Demonstration of Anti-Bacterial Activity of commonly available Fruit Extracts in Dhaka, Bangladesh. American Journal of Microbiological Research. 2: 68-73
Tenea, G., Lara, M. 2019. Compuestos Antimicrobianos Producidos por Weissella confusa Cys2-2 inhiben el crecimiento de bacterias gram-negativas. CyTA - Journal of Food. 17(1): 105-111